Transferencia de materialgenético II
Aislamiento de plásmidos yensayos de restricción
20 Octubre, 2009
Objetivos obtención de plásmido
Conocer los fundamentos para lapurificación del DNA plasmídico y suseparación del DNA
Realizar el aislamiento de DNAplasmídico
DNA
La extensión de DNAque tiene cadaorganismo no es lamisma.
El DNA a pesar de suextensión tiende aformar unaestructura helicoidalcompacta.
Estructura del DNA
Doble hélice
Estabilizada porpuentes dehidrógeno
En la célulageneralmentesuperempacadao superenrollada
Conformaciones de unplásmido
Linealizado: Es decir cuando se ha cortadoambas cadenas del DNA sólo una vez.
Parcialmente linealizado: Cuando se hacortado el DNA en una de las cadenas
DNA relajado circular. DNA que no se haempacado.
Superenrrolado: Covalentemente cerrado ymuy empacado
Superenrollado desnaturalizado. Parecidoal anterior pero un poco menos empacado
Superenrollamientoplásmido
Existen variasconformaciones de losplásmidos en el estadosuperenrollado.
Por lo que puedenmigrar en un campoeléctrico de maneramuy diferente cada unoa pesar de tener elmismo peso molecular
DNA se puede desnaturalizar
El calor, pH, laconcentración de iones,influyen en la estabilidadde la doble hélice.
En la desnaturalizaciónse deshace su estructuranativa, es decir seeliminan sus puentes dehidrógeno.
Dos hebras separadasque se pueden volver aunir.
La re-naturalización
El DNA se puedevolver a re-naturalizar.
Hay que hacerlo encondiciones suavespara que el apareo debases sea el correcto.
De no ser así sepueden produciragregados fácilmenteprecipitables.
Temperatura de fusión: Tm
Temperatura a la cual el50% del DNA seencuentra en la formadesplegada.
Al monitorear suabsorbancia a 260 nm seobserva que hay unaumento en estáconforme alteramos odespegamos la doblehélice EFECTOHIPERCRÓMICO
Fundamento
Cuando los puentes de hidrógeno entre las cadenascomplementarias del DNA plasmídico circular se rompen,ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, lascadenas permanecen cercanas ya que el enrollamiento delas dos cadenas no se ha perturbado grandemente.
En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNAcromosomal se renaturalizan rápidamente ya sea porenfriamiento o al restaurar el pH neutro de la solución y lafidelidad de la reasociación es substancialmente diferentepara ambas macromoléculas.
Continuación...
La re-naturalización de los plásmidos circulareses rápida porque las cadenas se encuentranpróximas. Mientras el DNA lineal se renaturalizamenos rapidamente formando agregados que sepueden remover de la suspensión porcentrifugación.
El plásmido permance en solución y puede serprecipitado con alcohol después de remover elDNA cromosomal.
Primeraparte
Clase jueves 22 octubre
Segundaparte
Clase jueves 22 octubre
Tercera parte
Una vez que se tenga el plásmidopurificado entonces:
A.Medir la absorbancia a 260 y 280 nm.
B.Estimar la concentración.
C.Correr una muestra en un gel deagarosa
D.Guardar a –20°C O HACERRESTRICCIÓN
Clase jueves 22 octubre
Obtención delplásmido
Determinaciónde concentración
Determinaciónde pureza
Determinaciónde integridad(corrimientoelectroforético)
Vector con inserto
Objetivos de ensayos derestricción de plásmidos
Conocer el principio de separación ydetección de ácidos nucleicos en geles deagarosa.
Emplear la electroforesis en geles de agarosapara visualizar ácidos nucleicos.
Determinar el tamaño de fragmentos deácidos nucleicos separados en geles deagarosa.
Conocer la utilidad de las enzimas derestricción en la transformación genética y labiotecnología.
Enzimas de restricción
Las endonucleasas se caracterizan por suhabilidad de reconocer una secuenciausualmente de 4 a 6 pares de bases (pb) ycortarla específicamente en ambas cadenasde la molécula de DNA.
Existen tres tipos de endonucleasas, las detipo II son las que se utilizan en biologíamolecular, debido a que son capaces decortar sobre la secuencia que reconocen y aque han perdido su capacidad de sermetilasas de DNA.
Restricción
Las endonucleasas se denominanenzimas de restricción, debido a quees la forma de defensa de las bacteriascontra la invasión por virus, es decir,restringen la invasión por el DNA viral.
Las enzimas de restricción reconocensecuencias palindrómicas
Palíndrome. segmentos de DNA que seleen igual de derecha a izquierda quede izquierda a derecha.
Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del nombre científico de labacteria de donde se aisló y se escribe en itálicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que laenzima proviene de Escherichia coli.
Extremos romos o cohesivos
Algunas enzimas de restricción rompen lasdos cadenas del DNA en posiciones nosimétricas del centro del palíndrome yproducen fragmentos con secuenciascomplementarias de una cadena,denominados extremos cohesivos.
Mientras que otras enzimas cortanexactamente sobre los dos ejes de simetría,produciendo extremos romos
¿Para qué extremos romos ocohesivos?
Las enzimas de restricción son unaherramienta experimental muy importante
Desarrollo de las técnicas para el análisis y lamanipulación de los ácidos nucleicos.
Han sido utilizadas en la eliminación desecuencias genómicas desde un nucleótidohasta cientos de bases,
En la introducción de secuencias distintas aun genoma, lo que ha permitido laproducción de proteínas recombinantes.
Mapas de restricción
Generalmente, un segmento de DNAcontiene secuencias blanco para variasenzimas de restricción.
Si un fragmento de DNA a analizar es losuficientemente extenso, se puede cortar conuna o varias enzimas de restricción, demanera individual o en mezclas. Un diagramade una molécula de DNA en donde semuestran los sitios de corte de las enzimasde restricción se denomina mapa derestricción.
Usos de los mapas derestricción
El análisis de los mapas de restricciónconstituyen una importante herramientapara localizar secuencias de basesespecíficas en un cromosoma y paraestimar el grado de diferencias entrecromosomas relacionados.
Vector
Sitio múltiplede clonación
Usos de las enzimas derestricción
Identificación de muestra
Ensayo de restricción
1.5 hincubación deDNA con 2enzimas: NdeI yBamHI.
Ensayo de restricción
Enzima derestricción
E1
E2
1 uL NdeI
+
+
1 uL BamHI
+
Clase jueves 22 octubre
Continúa..
Incubar a 37°C por 1.5 h.
Añadir 0,5 μl de RNasa (1 μg/ml)
Incubar 30 min a 37°C.
Guardar muestra a -20°C
Clase jueves 22 octubre
Clase del Jueves 29 de Octubre:Fase A
1.Preparación de un gel de agarosa
2.Preparación de muestras
3.Corrimiento electroforético: Gel de agarosacon bromuro de etidio (aprox 45 min).
4.Visualización del gel en UV.
5.Fotografía del gel.
6.Comparación con las bandas del marcadorde peso molecular
Preparación de un gel deagarosa
Migración en gel de Agarosa
En soluciones alcalinas, los fosfatos de losnucleótidos se encuentran cargadosnegativamente, entonces al imponer uncampo eléctrico, estas moléculas migranhacia el electrodo positivo o ánodo.
Cuando la migración toma lugar en un gel,las moléculas de DNA se separan de acuerdoa su tamaño, en donde las moléculaspequeñas se mueven más rápidamente através del poro del gel que las más grandes.